crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（1）確定目標基因
1樓：新科技
前陣子才寫道
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 month 4 --可能的收官之帖（但還遠未結束）
說自己收官之作，**想到這麼快就要繼續開始新的實驗了。
有幾點要宣告：首先，這些記錄都是我真是的實驗思路歷程，出於保密原則，不會透露課題任何敏感資訊，所有例子均為杜撰；其次，我知無不言但不一定能言盡，畢竟篇幅有限；再者，這些只是我個人的記錄，疑問僅是出於好意；之前有人問我要protocol，其實我想說，思路是最重要的，實驗protocol**去拿不到呢；最後，我感謝一直以來幫助我的人們，正是因為接受了這麼多的幫助，才促使我寫下這些紀錄希望能幫助到別人，感謝。
**上傳失敗。image-2bfdf5-1563514224716)]
首先知道自己要做什麼，明確目標之後要儘可能利用自己能用到的所有資源，快速，精準的篩選目的基因。
感謝師兄dz
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（6）正式轉染+單轉殖細胞篩選
2樓：戶如樂
先確定目標基因
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（1）
然後對目的基因進行背景調查
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（2）磨刀不誤砍柴工。
設計sgrna及引物
crispr-cas9（三）--sgrna設計好之後。
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（3）sgrna及引物設計。
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（4）構建sgrna+cas9載體。
轉染驗證
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（5）293ft細胞轉染驗證 and trouble shooting
事實上，在轉染驗證結束後，對於癌細胞等易轉染細胞系，基本上可以立刻進行轉染，如果載體帶有螢光，則根據螢光篩選陽性細胞，若載體為抗生素抗性，而經過抗生素篩選後可直接進行下一步單轉殖細胞篩選。對於難以轉染的細胞系，可使用電轉或者特殊的轉染試劑，再根據螢光或者抗性篩選。
將細胞消化過篩後種96孔板，每孔種乙個細胞，前提是要有活細胞工作站，可以定時拍照1星期以上，從而確定單細胞轉殖，如果沒有這樣的儀器，網路上還有其他篩選單細胞的教程，比如稀釋法等等（我覺得直接種1孔1個細胞就ok，種完就找到得力的顯微鏡全孔拍攝）。總而言之，篩選單細胞這一步依賴於實驗室平臺的條件。
我已經在前兩週完成了轉染+螢光篩選+擴增凍存一部分，目前種板準備篩選單細胞轉殖。由於我養的細胞屬於非常難轉的細胞系，使用了特殊的轉染試劑，轉染過後細胞不耐受，螢光篩選之後更加脆弱，實驗週期相應拉長。注意，最遲最遲在確認轉染成功後開始訂購所需的驗證性抗體。
實驗並非乙個人可以完成，這和實驗室的管理，補給，運營還有實驗室成員的幫助有很大的關係，每乙個微小的步驟都有可能把人卡得生不如死，希望能順順利利，感恩。
crispr-cas9基因敲除實驗步驟 day
3樓：戶如樂
這裡我們先前已經完成： crispr-cas9基因敲除sgrna設計。
1.輸入目標基因組dna序列。
我們提供**crispr設計工具可以輸入序列（例如，來自目的區域的乙個1kb基因片段），識別和排列合適的靶位點，計算**每個指定靶標的off-target位點。或者，可以通過確認任何5』-ngg直接上游的20-bp序列手動選擇引導序列。
設計ssodn模板（任選） 1 h我們沒有選這個方法--略。
3.設計和訂購定做的ssodn。
4.重新溶解和稀釋ssodn ultramers到終濃度10um。
5.為了構建sgrna表達結構，使用pcr表達cassette（選項a）或以質粒為基礎的步驟（選項b）--我們選擇了方案b
a）通過pcr擴增構建sgrna表達結構 2 h--沒選這個方案，略。
（b）sgrna cloning進入pspcas9（bb）質粒，與cas9共表達 3 d
pause point：此處理後，反應可以儲存在-20℃至少1周
感謝師兄dz
crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（3）sgrna及引物設計
4樓：天羅網
先確定目標基因crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（1）然後對目的基因進埋前行背景調查crispr/cas9基因敲除實驗全記錄（2）磨刀不氏困誤砍柴工設計sgrna及引物crispr-cas9（三）--sgrna設計好之後對殲液念前期文章的補充設計sgrna之後，需要對結果進行判斷：
提交訂單，等待引物到達：華大基因的速度非常快，大約在2-3個工作日即可拿到，在等待期間需要準備好：
感謝師兄dz
基於ARM9的溫度採集裝置設計，基於arm9的數字溫度監測系統設計好做嗎
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